我们对新冠病毒变异还是太大意了！
4月19日，李兰娟团队在预印本平台medRxiv上发表了最新研究成果，研究者分析了11份新冠患者分离毒株的突变特征，找到19个首次发现的新突变。值得注意的是，这些毒株在体外实验中表现出了非常大的致病性差异，不同毒株24小时病毒载量差最高达倍！
这是新冠病毒突变影响病毒致病性的首个直接证据。
论文的四位通讯作者分别为中国工程院院士李兰娟，浙江大学生命科学研究院研究员蒋超，浙江大医院教授吴南屏、郑敏。
我们知道，新冠病毒进入宿主细胞主要依赖S蛋白，其中受体结合域（RBD）部分是基因突变发生最频繁的部分。
截止今日上午，新冠病毒已经在全球范围内导致超过万确诊病例，死亡人数超过17万。在如此大规模的传播中，新冠病毒产生的突变是否已经对致病性产生本质上的影响了呢？了解这个问题，是指导药物和疫苗开发战略的关键一步。
为了解决这个问题，研究者们分析了来自真实新冠患者的病毒毒株。
研究涉及的11例新冠患者是浙大附一于年1月22日至年2月4日期间、疫情爆发早期收治的。11例患者中，5例确诊前在武汉工作或曾到访武汉，5例与武汉人员有密切接触，1例与新冠确诊人员有接触。4号、5号、9号患者曾与武汉同事出席同一个会议。
从流行病学角度，这11例患者已经构成了一代和二代感染病例。
11例患者中男性8人、女性3人，年龄从4个月至71岁不等。10例患者为中度及以上症状，3例有合并症，1例进行了ICU治疗。截止论文撰写，所有病人均已康复。
11例患者的详细特征
通过IlluminaNovasq平台对从这11例患者中分离出的毒株进行超深度测序，平均每个样本产生67.16Gb数据，过滤后得到M的reads。研究者总共找到了33个突变，对比3月24日在GISAID发布的个序列，其中19个突变是新的突变。
1号毒株中发现的两个突变（GT、GT）被认为是同一病毒大群的始祖突变，2号毒株和8号毒株中发现的两个突变（CT、TC）被认为另一病毒大群的始祖突变。
2、5、9、10、11号毒株中均发现的TG，此前仅在澳大利亚分离到的病毒株中有鉴定。与5、9参与同一会议的4号患者分离毒株存在一个新的突变AC，它在蛋白水平上导致与TG同样的错义突变。
11号毒株在ORF7B基因中有4个突变，其中3个连续，并导致2个蛋白错义突变。研究者认为这个三核苷酸突变是具有重要意义的，该毒株在之后的实验中表现出了极强的致病性，同时，11号患者也在临床上表现为罕见的持续45天核酸阳性。
虽然只检测了11株病毒，但从数据中我们可以看出，新冠病毒的多样性是非常丰富的。而且考虑到取样时间较早，但33个突变中19个是新突变的事实，我们对病毒多样性的认识还远远不足。
另外，11个毒株中，有三个取自粪便样本，这与之前报道粪便中不存在活病毒是完全相反的，新冠病毒可以在粪便中复制。
11个毒株的主要突变特征，蓝色为本次研究发现的新突变
为了解这11个毒株在进化上的背景，研究者从GISAID获取了个新冠病毒基因组，来源于蝙蝠的RaTG13毒株和广东穿山甲毒株作为外群。共计个病毒序列构建的系统发育树与目前GISAID更新的分析基本一致。
在发育树中可以观察到很多始祖突变，并表现出明显的地理模式，尤其是欧洲和美国。
将11个毒株整合进发育树，从图中可以看到，1号毒株所属的类群同时具有两种突变（GT、GT），该类群毒株大部分采集自荷兰和英国；2、8号毒株所属的类群具有两个同样的突变（CT、TC），该类群内存在来自美国西雅图的单源亚支；如前文所述，9、11号毒株由于TG与澳大利亚的分离株聚类。除此之外，其他毒株并不与已知的大规模病毒群聚类。
研究者认为，病毒群表现出的明显地理模式可能是由于大流行初期病毒突变的始祖效应。
发育树
那么基因突变到底会对病毒致病性造成什么样的影响？
由于临床上患者的病情受到个体年龄、共病等多种因素的影响，所以尽管已经有很多关于新冠病毒突变的研究，但我们至今还没有突变与病毒功能改变之间的直接证据。
为此，研究者进行了体外感染实验，选取的对象是Vero-E6细胞（猴肾细胞）。Vero-E6细胞虽然不是人类细胞，但是该细胞的ACE2蛋白与人类ACE2蛋白高度相似，实验中也可以被新冠病毒感染。
可观察到冠状病毒感染的“王冠”
研究者分别用11个毒株感染Vero-E6细胞，并在感染后1、2、4、8、24、48小时收集细胞，通过RT-PCR来检测循环阈值（Ct），Ct值越低表示病毒载量越高；同时在48小时和72小时时采用DIC显微镜观察细胞病理效应（CPE）。
在病毒入侵细胞的早期阶段，病毒复制较少，感染后1、2、4小时Ct值基本平稳；感染后8小时，6、7、9、10、11号毒株的病毒载量明显增加；感染后24小时，除了2、7号毒株，所有毒株病毒载量均显著上升，尤其10、11号毒株，载量增加明显快得多。
值得注意的是，不同类群毒株之间病毒载量的变化差异非常大。前文所提同属一个类群的2、8号毒株在感染后24小时病毒载量明显更低，另一类群的1号毒株载量则是它们的19倍。此外，感染后24小时，10号毒株与2号毒株的病毒载量相差近倍。
研究者认为，这些差异是由新冠病毒基因组突变导致的。
RT-PCR分别以ORF1a、E、N基因为靶基因
结果高度一致，故只讨论ORF1a
显微镜下观察结果显示新冠病毒的细胞病理效应和病毒载量是高度一致的，也就是说病毒载量越高，该毒株导致的细胞死亡率就越高。
该研究显示，新冠病毒存在大量的单核苷酸变异，而且与病毒致病性直接相关。在新冠疫情已经大流行的此刻，疫苗和药物的研发必须要考虑到这些突变的影响。
注：该论文发表于预印本平台，未经同行评审，不应用于指导临床实践。
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